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抗体亲和层析配体的分子动力学设计及纯化抗体能力的研究

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作者:
戴璐
导师:
孙非
学科专业:
医学生物工程学 
文献出处:
吉林大学 2016年
关键词:
分子动力学模拟论文  蛋白论文  抗体亲和配体论文  表面等离子共振论文  

摘要:近年来,抗体药物的发展十分迅速,具有较高的社会效益和经济效益。而抗体药物在生产过程中,下游的纯化所使用的填料作为一种耗材,消耗量很大,而国外抗体亲和填料产品价格较高,大大提高了抗体药物的生产成本。其中市面上最常见的用于抗体纯化的亲和配体为金黄色葡萄球菌蛋白A,它是由5个高度同源的抗体结合结构域组成的,这5个结构域都可以独立与抗体Fc片段及VH3亚类抗体Fab片段结合。其中D结构域与抗体Fab片段结合的复合物晶体已被解析出来,本论文选用该复合物晶体作为模型,目的是通过分子动力学模拟,突变可能影响D结构域与抗体结合的氨基酸残基,增大D结构域与Fab片段的结合能力。一方面是因为Fab段的结合研究较少,还有很大的研究空间;另一方面是因为结合Fab段的配体既可用于Ig G的纯化,也可用于Ig M的纯化,区别于在B结构域基础上开发的结合Fc片段的配体结合Ig M抗体量很低,不适用于Ig M纯化的特点。而采用分子动力学模拟技术的优势在于,可以在实验开始前对可能的结果进行预判,使实验的进行更具有方向性。为达到以上研究目的,本论文按照以下方案实施:1.采用MD模拟,对蛋白A的D结构域和Ig M抗体的复合物晶体进行模拟,找到可能阻碍D结构域与抗体Ig M结合的氨基酸残基位点,并对该位点进行突变改造,得到和抗体亲和力更强的突变体结构。2.因为曾有很多研究结果证明四联体串联配体对抗体的结合能力有明显提高。在本研究中对改造后的突变体和它的四联体进行大肠杆菌重组表达、中试发酵和纯化,得到D结构域和改造后的突变体蛋白,并比较突变体及其四联体和D结构域结合Ig G、Ig M抗体的能力。3.通过表面等离子共振技术(SPR)检测,定量比较D结构域、突变体单体和它的四联体对Ig G和Ig M抗体的结合能力。得到结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数等参数。4.把D结构域、突变体和突变体的四联体3种配体蛋白分别偶联到NHS预活化的琼脂糖基质上,在色谱条件下检验并比较了几种配体对Ig G、Ig M抗体的动态结合载量。通过上述实验,我们得到以下研究成果:1.通过对D结构域和Ig M复合物晶体结构的分析,我们发现D结构域上K46含有的正电荷对Ig M上K2589和R2611有阻碍结合的作用。我们尝试把K46突变为E46,因为E46带有负电荷不与Ig M上的K2589和R2611排斥。对两个结构最小结构体系的能量比较,可以得出结论K46E与Ig M的亲和力要强于D结构域。2.在对D结构域、K46E和K46E突变体3种蛋白的纯化过程中发现,对大肠杆菌细胞破碎后的上清液进行等电点沉淀,沉淀可以在中性条件下复溶,经过这一步骤的蛋白样品更易被镍柱结合。而这几种蛋白配体被镍柱结合后,四联体的洗脱条件比D结构域和K46E突变体2种蛋白温和,在中性含有咪唑的溶液中可以被洗脱,而单体蛋白需要在酸性条件下才能被洗脱。3.SPR的检测结果显示,D结构域和K46E相比,D结构域与Ig M的结合为慢速结合,慢速解离;K46E与Ig M的结合为快速结合,快速解离,亲和力明显增大。这一变化可能有利于K46E作为配体,在纯化抗体过程中增大纯化载量,也可以增大填料使用过程中的线性流速。四联体与Ig G、Ig M的结合速率、解离速率都明显增大,亲和力明显增强。证明了四联体作为配体的结合能力比单体强。4.从3种偶联抗体亲和层析填料纯化Ig G和Ig M的结果,可以观察到,K46E作为配体对Ig G的动态结合载量有明显增加,而对Ig M的动态结合载量没有明显改变,而K46E四联体对Ig G和Ig M的动态结合载量都有明显增加。本论文提供了一种抗体亲和层析填料开发策略,即在原有晶体结构基础上采用分子动力学模拟对配体结构进行改造,之后通过重组表达、发酵、纯化得到原配体蛋白和突变体蛋白。通过SPR技术得到改造前和改造后的配体对抗体的亲和能力的各项指标参数,再通过偶联填料基质检验它们对抗体纯化的能力。相信这一抗体亲和层析填料开发策略也可以用于对蛋白A其它结构域的改造,也有可能用于其它原理层析填料的开发。

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