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PDLA-PLLA立体复合水凝胶促进骨再生修复的研究

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作者:
王恩辉
导师:
孙新华
学科专业:
口腔临床医学专业学位 
文献出处:
吉林大学 2016年
关键词:
骨再生论文  明胶论文  去甲基斑蝥素论文  

摘要:牙周病所致牙槽骨吸收、腭裂等颌面部先天畸形、外伤和肿瘤等均可导致骨量不足或缺损,影响患者的咀嚼功能、颜面美观及身心健康,成为口腔医学领域的重要临床问题,因此骨增量与骨缺损修复是口腔医学的研究重点。应用传统方法移植自体或同种异体骨组织,价格昂贵并存在风险,且二次手术可增加患者痛苦、导致再次创伤并增加感染风险,此外,异体材料移植还具有传播传染性疾病和导致免疫排斥反应的可能性。伴随骨组织工程学的不断发展,新型支架材料为骨组织的修复再生提供了一种替代治疗方法。目前,多种海洋生物如珊瑚骨架、海胆和海绵已被作为三维生物支架和模板用于骨组织的再生。与其他遗传学或结构工程技术相比,这些材料价格低廉、来源广泛,具有骨再生所需的密度、形态,并具有孔的形状、尺寸和连通率。然而,这些材料的降解速率不可控,强度差,并存在一定的感染风险,因此限制了其应用。PLA、PGA及两者的共聚物PLGA是最广泛用于组织工程的人工合成可降解高分子材料。其应用形式为纤维支架、多孔状、泡沫及管状结构。PLA和PGA及其共聚物均属于α-聚酯类,这类材料在体内主要通过水解而降解,具备良好的生物相容性和可降解性,较为广泛地作为支架材料被用于骨组织工程。由于纳米材料的特异性能与纳米尺寸的特征,在生物医药领域展现出重要的应用前景。研究显示,纳米复合材料对于成骨的多个方面都有可控的影响,对于源于干细胞的骨生成,包括吸附、迁移、增殖、细胞信号、基因表达和干细胞分化也都有调控作用。伴随纳米技术的发展与成熟,生物材料的设计越来越致力于纳米尺寸元素的引进,使其产生细胞行为,促进功能组织的生成。水凝胶由于其自身所具备的仿生结构和与高度亲水性生物因子的相容性,已经成为骨组织工程的一种重要形式。水凝胶具有可控的降解性、独特的细胞相容性和可注射性。作为新兴的低成本治疗材料的代表,水凝胶支架可通过简单的化学官能团,无需复杂的高成本的生物分子,引起复杂的细胞反应。作为药物传输体系,水凝胶可通过表面功能化粒子的载入或者化学交联体系的引入(如环糊精)直接包裹生物制剂。因此,水凝胶支架已成功用于骨组织工程中治疗药物、抗体、生长因子、核酸和干细胞的靶向释放。本研究通过制备PDLA-PLLA立体复合水凝胶,构建一种新型复合材料,并通过体外、体内实验验证其促进骨再生的生物学性能。首先,利用PDLA与PLLA两种异构体能够形成空间立体复合物的作用,分别制备水溶性的PDLA-PEG-PDLA与PLLA-PEG-PLLA共聚物,同时纳入人体骨骼组织的主要无机组成成分纳米羟基磷灰石(n HA),诱导骨骼生长并为细胞粘附提供必要的位点;利用抗菌消炎的利福平作为模型药物;并用京尼平交联使体系更加稳定,制备出多功能的PDLA-PLLA立体复合水凝胶,通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)和X射线衍射分析(XRD)等研究其内部相互作用。扫描电镜的结果显示,异构聚合物的加入使材料孔洞丰富、连通性强、尺寸大小适度,更加有利于细胞的生长及营养物质的输送。溶胀指数实验证实,与无聚合物的对照组相比,该材料的溶胀度下降,降解速度减慢。该支架材料可根据需要包裹药物,如包裹模型药物利福平时,可使药物缓慢释放。将MC3T3-E1细胞接种于PDLA-PLLA立体复合水凝胶支架材料表面,通过扫描电子显微镜(SEM)、DAPI染色、MTT、实时定量PCR(Real-time PCR)及茜素红染色观察其对细胞粘附、增殖和成骨分化的影响,明确水凝胶支架材料促进成骨细胞分化的功能。扫描电镜的结果显示,Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen具有更强细胞相容性,利于细胞的粘附和增殖。细胞与PDLA-PLLA立体复合水凝胶粘附并发生后续伸展可反应细胞的适应过程,体现了PDLA-PLLA立体复合水凝胶的生物安全性。在PDLA-PLLA立体复合水凝胶上培养24h和72h,MC3T3-E1细胞伸展充分,细胞排列紧密。DAPI染色与MTT检测发现,与对照组和空白组相比,实验组细胞在第3天和第5天粘附数量增高;与Gel+n HA+Gen水凝胶相比,Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen立体复合水凝胶的促细胞增殖作用更加明显,表明立体复合水凝胶材料更利于细胞增殖,更具有亲和性。茜素红染色结果显示,与空白组比较,Gel+n HA+Gen组细胞的成骨能力增强;与Gel+n HA+Gen组相比,Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen组的成骨能力进一步增强。实时定量PCR检测发现,PDLA-PLLA立体复合水凝胶在体外可促进小鼠前成骨细胞向成骨细胞分化,证实PDLA-PLLA立体复合水凝胶具有较好的成骨细胞相容性。为进一步研究支架材料在体内的促成骨作用,建立了SD大鼠颅骨临界尺寸缺损模型,将水凝胶支架材料植入颅骨缺损处,Micro-CT和苏木素-伊红染色观察6周和12周骨缺损愈合情况,对实验模型进行Micro-CT检测和组织学观察,观察凝胶材料植入大鼠体内修复颅骨缺损的性能,评价凝胶材料Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen、Gel+n HA+Gen在动物体内的生物相容性,评价本研究制备的凝胶材料Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen用于引导骨组织再生领域的可行性和有效性。结果显示,Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen、Gel+n HA+Gen植入骨缺损处可见与周围宿主骨结合良好,没有见到明显的炎症反应,该凝胶材料具有良好的组织相容性;Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen引导新骨生成的面积显著高于Gel+n HA+Gen引导新骨生成的面积,提示Gel+PDLA/PLLA+n HA+Gen成功地促进了实验动物SD大鼠颅骨临界尺寸缺损模型的骨组织的再生。为了进一步拓展PDLA-PLLA立体复合水凝胶材料的应用,本研究利用该支架载药对骨恶性肿瘤实现原位治疗进行了初步探讨。首先研究制备了一种抗癌药物,将奥沙利铂和去甲基斑蝥素(DMC)的生物活性相结合,合成了四价的铂复合物,构建成聚合物-药物键合体系用于联合化疗,将其加入到PDLA-PLLA立体复合水凝胶支架材料中。PDLA-PLLA立体复合支架作为该药物的缓释载体,奥沙利铂可以通过还原作用从聚合物-药物键合体系中释放,攻击肿瘤细胞的DNA,随后DMC水解释放,通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A),屏蔽DNA损伤诱导的耐药,通过这种奥沙利铂和DMC协同的药物双模式的作用,从而使水凝胶体系在骨修复的同时实现骨恶性肿瘤的原位治疗。结果显示奥沙利铂和去甲基斑蝥素合成的聚合物-药物键合体系对卵巢癌细胞SKOV-3的杀伤作用高于单独用药。这种增强的细胞毒性是由于奥沙利铂和DMC的协同作用,细胞摄入的情况也可通过激光共聚焦显微镜(CLSM)清楚地看到,避免了单一的化疗药物可能带来的耐药性及疗效差的问题。PDLA-PLLA立体复合水凝胶体系内加入抗恶性肿瘤药物,从而进一步延伸了水凝胶体系在骨组织修复方面的应用,使其在引导骨再生修复的同时杀伤肿瘤细胞,实现对骨恶性肿瘤的原位治疗。

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