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TRIM59和COMMD9促进非小细胞肺癌增殖和迁移的分子机制研究

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作者:
詹伟华
导师:
王建斌
学科专业:
生物学 
文献出处:
南昌大学 2016年
关键词:
细胞周期论文  非小细胞肺癌论文  

摘要:第一部分TRIM59促进非小细胞肺癌增殖和迁移研究目的:TRIM家族是一类在炎症、免疫、抗病毒和癌症发生发展过程中有重要作用超家族蛋白。作为TRIM家族的一员,之前有文献报道TRIM59通过泛素化p53促进胃癌的发生发展,但是TRIM59在非小细胞肺癌(NSCLC)中的生理学功能和作用机制并不清楚。本课题通过QPCR方法,得到TRIM蛋白家族成员在非小细胞肺癌中的m RNA表达情况。进一步探讨TRIM59对非小细胞肺癌细胞生长、迁移和细胞周期的影响及其作用机制。研究方法:1、用QPCR方法筛选4株非小细胞肺癌细胞(H1299,A549,SPC-A1和H292)相对于正常人类支气管上皮细胞(HBE)中差异表达的TRIM基因。2、在蛋白水平上验证各株细胞中TRIM59表达情况,并且检测其在14种人类正常组织中的表达情况。3、在转染TRIM59特异性si RNA情况下,通过饱和密度实验、低血清实验、克隆集落形成实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和免疫荧光实验,检测干扰TRIM59表达对非小细胞肺癌细胞生长、迁移和细胞周期的影响。4、降低TRIM59表达水平,然后进行QPCR实验,免疫蛋白印迹实验,检测细胞周期蛋白和p53蛋白表达情况。研究结果:1、相比于HBE细胞,在4株NSCLC细胞中TRIM3、TRIM7、TRIM14、TRIM16、TRIM21、TRIM22、TRIM29、TRIM59、TRIM66和TRIM70高表达,TRIM4、TRIM9、TRIM36、TRIM46、TRIM54、TRIM67和TRIM76低表达。而TRIM17、TRIM40、TRIM42、TRIM43、TRIM48、TRIM49、TRIM50、TRIM51、TRIM60、TRIM63、TRIM64和TRIM77在NSCLC细胞和HBE细胞中未检测到。2、相比于HBE细胞,TRIM59蛋白在4株NSCLC细胞中高表达。TRIM59在骨髓和脾脏中高表达,在肺和肌肉中低表达,而在其它正常组织(脂肪、血液、直肠、心脏、肾脏、肝脏、淋巴结、皮肤、胃和睾丸)中未检测到。3、干扰TRIM59蛋白表达明显抑制NSCLC细胞生长、克隆集落形成、迁移,并且G2/M期细胞增多,PCNA蛋白表达降低。4、干扰TRIM59蛋白表达,细胞周期蛋白CDC2、CCNA2、CCNB1、CCNB2和CDC25C的m RNA水平降低,其中CDC2和CDC25C蛋白水平也降低,而CCNB1的蛋白水平没有变化。在4株NSCLC细胞和HBE细胞中干扰TRIM59表达,发现H1299细胞中未检测到p53表达,HBE、H292和A549细胞中p53表达没有改变,而在SPC-A1细胞中p53蛋白水平有所降低。研究结论:1、TRIM59在NSCLC细胞中高表达,并且促进NSCLC细胞生长、克隆集落形成和迁移。2、TRIM59促进NSCLC细胞从DNA合成后期进入细胞分裂期,并且上调细胞周期蛋白的表达。3、TRIM59并非通过p53信号通路来影响NSCLC细胞的生理学行为。第二部分COMMD9在非小细胞肺癌中与TFDP1结合促进TFDP1/E2F1转录活性研究目的:COMMD家族是在炎症、铜离子代谢、钠离子稳态、胞内分选和癌症中发挥重要作用的一类蛋白家族。文献报道COMMD9可能与TFDP1有相互作用,但是还未验证,并且COMMD9在癌症中的作用还未见报道。本课题的研究目的是探讨COMMD9对非小细胞肺癌生长、迁移、细胞周期和自噬的影响,检测COMMD9和TFDP1是否有相互作用及作用形式,并且是否对TFDP1/E2F1转录活性有影响。研究方法:1、用QPCR方法筛选4株非小细胞肺癌细胞(H1299,A549,SPC-A1和H292)相对于正常人类支气管上皮细胞(HBE)中COMMD家族差异表达基因。用免疫蛋白印迹(Western blot)实验检测COMMD9蛋白在NSCLC细胞和组织中的表达情况。2、用si RNA干扰COMMD9表达,通过结晶紫染色实验、克隆集落形成实验、软琼脂实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot实验,检测降低COMMD9表达对非小细胞肺癌细胞生长、迁移、细胞周期和自噬的影响。3、构建相关质粒,通过免疫共沉淀实验研究COMMD9和TFDP1相互作用及作用结构域。4、干扰COMMD9表达,采用荧光素酶报告基因、QPCR和Western blot方法,检测TFDP1/E2F1转录活性变化,以及p53信号通路的改变。研究结果:1、相比于HBE细胞,在4株NSCLC细胞中COMMD3、COMMD4、COMMD5和COMMD8的m RNA水平低表达,而COMMD9的m RNA和蛋白水平都高表达。NSCLC组织中COMMD9蛋白表达高于对应的癌旁组织。2、干扰COMMD9表达明显抑制NSCLC细胞生长、克隆集落形成、迁移,阻滞细胞G1期到S期的进程,并且促进自噬的发生。3、成功构建COMMD9和TFDP1全长以及截短的表达质粒,COMMD9可以和TFDP1发生相互作用。COMMD9的COMM结构域和TFDP1的DNA结合结构域是这两个蛋白相互作用的主要结合区域。4、干扰COMMD9表达抑制TFDP1/E2F1转录活性及下游基因的表达,并且p53蛋白水平上调,p53下游基因的表达也受到影响。研究结论:1、COMMD9在NSCLC中高表达,并且促进NSCLC细胞生长、克隆集落形成、迁移,促进细胞周期从DNA合成前期进入DNA合成期,并且抑制细胞自噬。2、COMMD9通过COMM结构域与TFDP1结合,并且TFDP1中DNA结合结构域对于这两个蛋白的相互作用是必需的。3、COMMD9促进TFDP1/E2F1转录活性,并且抑制p53信号通路。

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