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抗组蛋白H4K8cr兔单克隆抗体的制备及初步鉴定

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作者:
吴位芳
导师:
吴石金,谭兴梅
学科专业:
生物工程 
文献出处:
浙江工业大学 2016年
关键词:
单克隆抗体论文  制备论文  鉴定论文  

摘要:背景:巴豆酰化是一种进化高度保守的翻译后修饰。组蛋白H4第8位氨基酸赖氨酸巴豆酰化(H4K8cr)主要富集在人类体细胞和小鼠雄性生殖细胞中的基因活性转录启动子区和增强子处。由于受到催化Kcr酶研究的限制,目前关于更多的组蛋白Kcr机制及功能研究仍然很少。开发针对组蛋白的翻译后修饰(post-translational modifications,PTM)抗体是进一步揭示新型表观遗传标记在肿瘤发生、发展与药物治疗中的作用机理的重要方法。兔单克隆抗体具有亲和力高和特异性强的优点,更适合PTM类抗体的开发。目前急需开发H4K8cr的兔单克隆抗体,以便加快其生物学功能的探索和研究。目的:利用兔单克隆杂交瘤技术和重组抗体技术开发能应用于免疫印迹、免疫组化和免疫细胞化学的H4K8cr兔单克隆抗体。方法:用人工合成的2段多肽H4K8cr多肽,与钥孔血蓝蛋白(H4K8cr-KLH)交联混合免疫4只新西兰大白兔,获得最佳免疫效果的兔脾细胞与240E-W2兔骨髓瘤样细胞株融合,运用间接ELISA法筛选能分泌anti-H4K8cr抗体杂交瘤细胞株。ELISA阳性的杂交瘤细胞株上清进一步通过Western blot、Peptide array等方法进行特异性验证。Peptide array特异性最好、Western blot信号最强的一株细胞通过重组表达,超滤浓缩最终得到的抗体通过ELISA、Western Blot、IHC、ICC、Peptide array等方法进行特异性鉴定。结果:初步筛选获得114株ELISA阳性克隆,20株Western blot阳性克隆,选一株1株Peptide array特异性最好的克隆73号进行重组表达,共获得2 mL IgG浓度为1.562mg/mL的抗体。其效价为1:409600(1×100×212)。Western blot检测人HeLa、小鼠3T3、大鼠C6和PC-12四种细胞均能检测到11 KD的条带。IHC和ICC结果显示anti-H4K8cr染色细胞定位在细胞核。ELISA方法验证与K8非修饰多肽无交叉反应。Peptide array显示与目前已研究发现的H2A、H2B、H3和H4上的所有巴豆酰化和乙酰化修饰位点均无交叉。结论:利用兔单克隆抗体杂交瘤开发技术和重组开发技术,率先开发成功anti-H4K8cr的兔单克隆抗体,并能应用于ELISA、WB、IHC、ICC、Peptide array等免疫学检测,且与鼠源组织或细胞株能反应,验证了兔单克隆抗体的优势,可促进巴豆酰化的相关研究。

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